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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22588 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung und Demonstration neuartiger Desinfektionstechnologien zum Schutz vor verschiedenen pathogenen Viren und Bakterien. In diesem Zusammenhang bietet die ultraviolette (UV) Bestrahlung eine wirksame und bequeme Methode zur Inaktivierung pathogener Mikroorganismen. Die quantitative Bewertung der Wirksamkeit der UV-Sterilisation basiert auf dem einfachen Zeit-Dosis-Reziprozitätsgesetz von Bunsen-Roscoe. Die in der Literatur angegebenen Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten variieren jedoch stark, selbst bei gleicher Bestrahlungsdosis und -wellenlänge. Daher ist es wahrscheinlich, dass der physikalische Mechanismus der UV-Inaktivierung nicht durch das einfache Zeit-Dosis-Reziprozitätsgesetz beschrieben werden kann, sondern einen sekundären Inaktivierungsprozess erfordert, der identifiziert werden muss, um die wissenschaftliche Grundlage zu klären. In dieser Arbeit haben wir ein UV-Inaktivierungsexperiment mit Escherichia coli bei derselben Dosis, aber unterschiedlichen Bestrahlungsstärken und Bestrahlungsdauern durchgeführt und dabei die Bestrahlungsstärke um zwei bis drei Größenordnungen variiert. Wir haben gezeigt, dass sich die Wirksamkeit der Inaktivierung durch Bestrahlung mit UV-Leuchtdioden bei gleicher Dosis, aber unterschiedlicher Bestrahlungsstärke bei einer festen Wellenlänge deutlich um eine Größenordnung unterscheidet. Um dies zu erklären, haben wir ein stochastisches Modell erstellt, das eine zweite Inaktivierungsrate einführt, beispielsweise die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die zur DNA- und/oder Proteinschädigung beitragen, zusammen mit der fluenzbasierten UV-Inaktivierungsrate. Durch die Lösung der auf diesem Modell basierenden Differentialgleichungen konnte die Wirksamkeit der Inaktivierung als Funktion der Bestrahlungsstärke und Bestrahlungsdauer unter gleichen UV-Dosisbedingungen klar aufgeklärt werden. Das vorgeschlagene Modell zeigt deutlich, dass an der UV-Inaktivierung mindestens zwei Inaktivierungsraten beteiligt sind, wobei die allgemein verwendete UV-Inaktivierungsrate nicht von der Bestrahlungsstärke abhängt, die Inaktivierungsrate aufgrund von ROS jedoch von der Bestrahlungsstärke abhängt. Wir kommen zu dem Schluss, dass die bisher erzielten UV-Inaktivierungsergebnisse einfach durch eine Inaktivierungsrate angepasst wurden, die diese beiden Inaktivierungsraten überlagerte. Die Wirksamkeit einer langfristigen UV-Bestrahlung bei geringer Bestrahlungsstärke, aber gleicher Dosis liefert nützliche Informationen für zukünftige Desinfektionstechnologien wie die Desinfektion großer Räume, beispielsweise von Krankenzimmern, mit UV-Licht, da dadurch die Strahlendosis und deren Risiko verringert werden können zum menschlichen Körper.

Es besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung und Demonstration effizienter Desinfektionstechnologien zum Schutz vor verschiedenen pathogenen Viren und Bakterien. In dieser Situation stößt die Sterilisation durch ultraviolette (UV) Bestrahlung auf besonderes Interesse, da UV-Bestrahlung eine wirksame und bequeme Methode zur Inaktivierung pathogener Mikroorganismen, einschließlich Coronaviren, darstellt1,2,3,4,5.

Das Prinzip der Sterilisation beruht auf dem von Bunsen-Roscoe6 vorgeschlagenen Zeit-Dosis-Reziprozitätsgesetz, Log(N/N0) = − Γ × D, wobei Γ (cm2/mJ) die Inaktivierungsratenkonstante in Abhängigkeit von der Wellenlänge ist, D = τ × P, D (mJ/cm2) ist die UV-Dosis, P (mW/cm2) ist die UV-Bestrahlungsstärke und τ (s) ist die Bestrahlungsdauer (im Folgenden verwenden wir D als UV-Dosis, P als UV-Bestrahlungsstärke und τ als Bestrahlungsdauer.). Dieses Reziprozitätsgesetz wurde auf viele verschiedene Kategorien von Photoreaktionsprozessen angewendet, wie z. B. Photopolymerisation, Photoleitfähigkeit und Photoabbau sowie UV-Sterilisation7. Das Reziprozitätsgesetz geht davon aus, dass die Geschwindigkeit des photochemischen Reaktionsprozesses proportional zur Lichtbestrahlungsstärke ist (linearer stochastischer Prozess), sodass das Ausmaß des Prozesses nur von D abhängt. Dies gilt zwar für die meisten primären photochemischen Reaktionprozesse bei Lichtbestrahlungsstärken, die Obwohl sie keine nichtlinearen Effekte induzieren, gibt es viele Reaktionen, die dem Reziprozitätsgesetz über keinen signifikanten Bereich von Reaktionsbedingungen hinweg nicht gehorchen, wie z. B. radikalische Polymerisationen8. Darüber hinaus variieren die in der Literatur angegebenen Inaktivierungsratenkonstanten vieler Bakterien und Viren durch UV-Bestrahlung stark, selbst für Studien, in denen dieselbe Strahlungswellenlänge und dieselben Arten und Stämme von Bakterien und Viren verwendet wurden9,10,11. Diese große Bandbreite der gemeldeten Werte scheint darauf hinzudeuten, dass der physikalische Mechanismus der UV-Inaktivierung nicht durch das einfache Zeit-Dosis-Reziprozitätsgesetz beschrieben werden kann; Stattdessen muss ein sekundärer Inaktivierungsprozess identifiziert werden, um die wissenschaftliche Grundlage zu klären7.

In dieser Arbeit schlagen wir ein stochastisches Modell vor, um die verschiedenen Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten für denselben D zu erklären. Um das hier vorgeschlagene stochastische Modell zu validieren, führten wir ein UV-Inaktivierungsexperiment bei demselben D, aber unterschiedlichen Ps und τs bei einer festen Wellenlänge durch, variierend das P um zwei bis drei Größenordnungen. Hier haben wir Escherichia coli (E. coli) als Inaktivierungsprobe verwendet, da dieses Bakterium zu den Standardproben gehört, die bisher in UV-Inaktivierungsexperimenten verwendet wurden12,13,14,15,16,17,18,19. Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass bei 265 nm die Wirksamkeit der Inaktivierung für längere τs mit einem niedrigeren P bei gleichem D größer ist. Diese Tendenz war jedoch bei 280 nm weniger ausgeprägt, und wir konnten bei diesem keinen so signifikanten Unterschied beobachten Bestrahlungswellenlänge von 308 nm.

Um die Wirksamkeit der Inaktivierung als Funktion von P und τ unter den gleichen D-Bedingungen zu erklären, haben wir zwei Sätze stochastischer Differentialgleichungen erhalten, in denen eine Inaktivierungsrate [wie die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS)], die zur DNA beiträgt, bestimmt wird /oder Proteinschäden wurden zusammen mit der herkömmlichen UV-Inaktivierungsrate eingeführt. Durch numerisches Lösen der auf diesem Modell basierenden Differentialgleichungen kann die Wirksamkeit der Inaktivierung als Funktion von P und τ für dasselbe D klar erklärt werden. Das vorgeschlagene Modell zeigt deutlich, dass an der UV-Inaktivierung mindestens zwei Inaktivierungsraten beteiligt sind, wobei die allgemein verwendete UV-Inaktivierungsrate nicht vom P abhängt, die andere Rate jedoch schon. Unsere Schlussfolgerung legt nahe, dass die bisher erzielten UV-Inaktivierungsergebnisse einfach durch eine Inaktivierungsrate angepasst wurden, die diese beiden Inaktivierungsraten überlagerte.

Eine Reinkultur des E. coli-Stammes O1 wurde in Nährbrühe (E-MC63; EIKEN Chemical Co., Japan) 20 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Für die Experimente wurde eine Konzentration von 109 bis 1011 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml ermittelt und verwendet. Die Reinkultur von E. coli in der stationären Phase wurde entnommen und mit einer normalen Kochsalzlösung (9 g NaCl, gelöst in 1 l gereinigtem Wasser) auf 103 bis 105 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml verdünnt. Um die Inaktivierungsexperimente mit UV-LEDs durchzuführen, wurden 600 μL der dispergierten Lösung entnommen und in ein Mikroröhrchen injiziert. Nach den Inaktivierungsexperimenten wurden 100 μl Bakterienzellen entnommen und auf Agarplatten verteilt. Die Kolonien wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C gezählt. Die Anzahl der KBE/ml in der Kontrollsuspension (ohne UV-Bestrahlung im Ultraschallbad) wurde so angepasst, dass die Anzahl der KBE in einer Platte nach der UV-Bestrahlung im Bereich von 102 liegt. Zur Zählung der KBE im Bereich von 101 bis 104 Wir haben ein digitales Bild der Platte gemacht und die Verarbeitungssoftware (https://processing.org/) zur Berechnung der KBE verwendet.

Abbildung 1a zeigt den Bestrahlungsaufbau für das Inaktivierungssystem. UV-Belichtungsexperimente wurden mit UV-LEDs mit 265, 280 oder 308 nm (265 nm: 265-FL-01-G01, 280 nm: 280-FL-01-G01 und 308 nm: 308-FL-01-G01) durchgeführt , DOWA ELECTRONICS MATERIALS CO., LTD., Japan). Die UV-Spektren der in diesem Zustand verwendeten UV-LED-Wellenlängen (265 nm, 280 nm und 308 nm) wurden mit einem Spektrometer durch eine optische Faser (BIM-6002A, Brolight Technology Corporation, Hangzhou, China) gemessen. Wie in Abb. 1b gezeigt, zeigten die 265-nm-, 280-nm- und 308-nm-UV-LEDs eine Spitzenwellenlängenemission bei 266,5 nm, 280,6 nm bzw. 308,8 nm mit einer Vollbreiten- und Halbwertsbandbreite von 11,1 nm bzw. 11,5 nm und 12,0 nm. Für die UV-Inaktivierungsexperimente wurde die UV-Bestrahlungsstärke durch die Kombination von UV-NIR-Neutraldichtefiltern (ND) (Nr. 88-369, Edmund Optics Japan Ltd., Tokio, Japan) variiert, deren optische Dichte (OD) variiert wurde 0,3 bis 3,5. Wir stellen hier fest, dass wir die an die UV-LEDs angelegte Spannung nicht wesentlich geändert haben, um die gleichen Ps zu erhalten, sondern sie bei ungefähr ihrer Nennspannung verwendet haben, um spektrale Spitzenverschiebungen zu verhindern, die durch eine Änderung der angelegten Spannung verursacht werden. Darüber hinaus ändert sich die Transmission von UV-NIR ND-Filtern zwischen 200 und 300 nm deutlich. Daher wurden für die UV-Belichtungsexperimente unterschiedliche Größen von P verwendet, wie in Tabelle 1 gezeigt.

Optischer Aufbau des UV-Inaktivierungssystems und Emissionsspektrum von UV-LEDs. (a) Optischer Aufbau des UV-LED-Inaktivierungssystems. (b) Emissionsspektren von 265 nm, 280 nm und 308 nm UV-LEDs. Diese LEDs zeigten Spitzenwellenlängenemissionen bei 266,5 nm, 280,6 nm bzw. 308,8 nm mit Vollbreiten- und Halbwertsbandbreiten von 11,1 nm, 11,5 nm und 12,0 nm. (c) Foto einer E. coli-Bakterienprobe, die mit der UV-LED in einem Ultraschallbad bestrahlt wurde. Als Kontrollprobe wurde auch eine E. coli-Bakterienprobe ohne UV-Bestrahlung in das Ultraschallbad gegeben, um die durch Ultraschallschwingungen verursachte Inaktivierung zu berücksichtigen.

Anschließend wurde die UV-Strahlung nach der Transmission durch ND-Filter mithilfe einer konvexen Linse mit einer Brennweite von 80 mm kollimiert und zu einem Mikroröhrchen aus Polypropylen (2-8007-02, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) geleitet enthielt eine Suspension von E. coli (600 μL). Der erhaltene Strahldurchmesser betrug ungefähr 20 mm und der Durchmesser der Mikroröhre betrug 9 mm; Daher wurde der gesamte Bereich der Suspension mit UV-Strahlung bestrahlt. Der P der UV-Strahlung, der die Bakterien ausgesetzt waren, wurde jedes Mal gemessen, indem eine UV-erweiterte Si-Fotodiode mit einer Apertur von 9,5 mm (S120VC, Thorlabs Inc., New Jersey, USA) auf der Oberfläche des Mikroröhrchens platziert wurde. Basierend auf diesem Messwert wurde das τ bestimmt. Die Kombinationen von P und τ bei jeder Bestrahlungswellenlänge sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Suspension im Rohr wurde mithilfe eines Ultraschallbades (MCS-2, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) mit einer Frequenz von 40 kHz und einer Ausgangsleistung von 55 W homogen diffundiert. Die Temperatur des Ultraschallbades wurde bei 23 °C gehalten °C durch Verwendung eines Wärmetauschers, der den Temperaturanstieg verhinderte, der durch 60-minütigen Ultraschallbetrieb verursacht wurde. Ohne den Wärmetauscher wäre die Temperatur des Mikroröhrchens während des 60-minütigen Ultraschallbetriebs (nicht aufgrund der UV-Bestrahlung) auf etwa 50 °C angestiegen. Die Kontrollsuspension, die keiner UV-Bestrahlung ausgesetzt war, wurde bei jeder Messung ebenfalls in das Ultraschallbad gegeben, um die durch Ultraschall verursachte Inaktivierung genau von der durch UV-Bestrahlung verursachten zu unterscheiden und auszuschließen, wie in Abb. 1c dargestellt. Wir stellen hier fest, dass die durch 60-minütige Ultraschallbehandlung verursachte KBE-Reduktion weniger als 10 % der KBE der ursprünglichen Kontrollprobe betrug20,21,22.

Die logarithmische Inaktivierung wurde als Log (N/N0) mit der Basis 10 berechnet, wobei N die KBE-Zahl nach UV-Bestrahlung im Ultraschallbad und N0 die KBE-Zahl ohne UV-Bestrahlung im Ultraschallbad ist. Dieses Verfahren wurde in jedem Experiment durchgeführt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistischen Analysen der Daten wurden mithilfe eines gepaarten Student-t-Tests durchgeführt. Die p-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Das Inaktivierungsverhältnis [Log(N/N0)] bei gleichem D, aber unterschiedlichen Ps und τs wird als Funktion von τ (von 0 bis 1000 s) durch rote Kreise (10 mJ/cm2) und blaue Kreise (5 mJ/cm2) aufgetragen. cm2) wie in Abb. 2a,b,c gezeigt (a: 265 nm, b: 280 nm, c: 308 nm). Hier sind die gewählten Werte von P und τ in Tabelle 1 aufgeführt [(a) 265 nm; 5 mJ/cm2, (b) 265 nm; 10 mJ/cm2, (c) 280 nm; 5 mJ/cm2, (d) 280 nm; 10 mJ/cm2, (e) 308 nm; 5 mJ/cm2 und (f) 308 nm; 10 mJ/cm2].

Experimentelle Diagramme des Inaktivierungsverhältnisses [Log(N/N0)] für verschiedene Bestrahlungsdauern (und verschiedene Bestrahlungsstärken) bei Dosen von 10 mJ/cm2 (rote Kreise) und 5 mJ/cm2 (blaue Kreise) und Bestrahlungswellenlängen von (a) 265 nm, (b) 280 nm und (c) 308 nm. Die rote bzw. blaue Linie stellt das theoretisch angepasste Inaktivierungsverhältnis als Funktion der Bestrahlungsdauer bei konstanter Dosis (rot: 10 mJ/cm2, blau: 5 mJ/cm2), aber unterschiedlichen Bestrahlungsbedingungen dar. (d) Bestimmung von Γ1 durch die anfängliche Steigung der Kurve für 265 nm und 10 mJ/cm2 ergibt sich, wobei die grüne Kurve durch Γ1 = 2 × 10−4 cm3/s und die rote Kurve durch Γ1 = 2 beschrieben wird × 10−3 cm3/s, und die blaue Kurve wird durch Γ1 = 2 × 10−2 cm3/s beschrieben. (e) Bestimmung von Γ2 anhand der Endsteigung der Kurve für 265 nm und 10 mJ/cm2-Ergebnisse, wobei die grüne Kurve durch Γ2 = 0,07 cm2/mJ und die rote Kurve durch Γ2 = 0,7 cm2/mJ beschrieben wird. und die blaue Kurve wird durch Γ2 = 7,0 cm2/mJ beschrieben. (f) Die Bestimmung von Γ4 anhand der Schwanzhöhe der Kurve für 265 nm und 10 mJ/cm2 ergibt sich, wobei die grüne Kurve durch Γ4 = 2,8 cm3/s und die rote Kurve durch Γ4 = 28 cm3/s beschrieben wird ( rote Kreise sind experimentelle Ergebnisse) und die blaue Kurve wird durch Γ4 = 280 cm3/s beschrieben.

Für 265-nm-Bestrahlung und D = 10 mJ/cm2 [rote Kreise in Abb. 2a] beträgt die Reduzierung des P um zwei bis drei Größenordnungen (Hier vergleichen wir die Verhältnisse, die für τ≒0 s und τ≒1000 s erhalten wurden. ) führt zu einer signifikanten Verringerung des Verhältnisses um etwa eine Größenordnung, was darauf hindeutet, dass die Wirksamkeit der Inaktivierung bei längeren τs und einem niedrigeren P etwa zehnmal größer war (p-Wert < 0,05). Durch Senken des D von 10 mJ/ cm2 bis 5 mJ/cm2, wie in den blauen Kreisen in Abb. 2a dargestellt, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Allerdings war der Unterschied in den Verhältnissen bei verschiedenen Ps weniger ausgeprägt und die Wirksamkeit der Inaktivierung wurde auf etwa das Siebenfache reduziert (p-Wert < 0,05).

Bei gleichem D wurden mit 280-nm-Bestrahlung ähnliche Ergebnisse erzielt, wie in Abb. 2(b) gezeigt (rote Kreise: 10 mJ/cm2 und blaue Kreise: 5 mJ/cm2). Der Unterschied in den Verhältnissen bei verschiedenen Ps war weniger ausgeprägt. Beispielsweise war die Wirksamkeit von D = 10 mJ/cm2 etwa 7-mal größer (p-Wert < 0,05) und die von D = 5 mJ/cm2 etwa 5-mal größer (p-Wert < 0,05) für längere τ (τ). ≒1000 s) und niedrigere P im Vergleich zu kürzeren τ (τ ≒0 s) und höheren P.

Bei der Bestrahlungswellenlänge von 308 nm konnten wir jedoch keine signifikante Verringerung der Verhältnisse durch Änderung des P unter den gleichen D-Bedingungen beobachten, wie in Abb. 2c gezeigt. Beispielsweise war die Wirksamkeit von D = 10 mJ/cm2 (rote Kreise) ungefähr 1,3-mal höher (p-Wert = 0,19) und die von D = 5 mJ/cm2 (blaue Kreise) ungefähr 1,2-mal höher (p-Wert). = 0,23) für längere τ (τ ≒1000 s) und niedrigere P im Vergleich zu kürzeren τ (τ≒0 s) und höheren P. Die p-Werte zeigen jedoch, dass es keinen statistischen Unterschied im Verhältnis zwischen längeren und kürzeren τs gibt .

Die anfängliche KBE wurde zwischen 102 und 104 variiert, um zu untersuchen, ob die Reduktionsverhältnisse von der Anzahl der anfänglichen KBE abhängen. Wie Hamamoto et al.23 ebenfalls beobachteten, konnten wir jedoch keine signifikante Änderung der Reduktionsverhältnisse beobachten.

Für die Analyse der UV-Inaktivierung24,25,26 werden im Allgemeinen Zieltheorien mit Single-Hit- oder Multihit-Modellen verwendet, und das Bunsen-Roscoe-Gesetz6 ist das Grundprinzip für die Analyse der UV-Inaktivierung. Der große Unterschied in der Wirksamkeit der Inaktivierung bei gleichem D, aber unterschiedlichen Ps bei einer festen Wellenlänge kann durch diese Theorien jedoch nicht erklärt werden. Andererseits ist allgemein bekannt, dass UV-Strahlung reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt und dass ROS DNA, Membranen und Zellen schädigen27,28. Jüngste Ergebnisse legen nahe, dass ROS eine wichtige Rolle bei der UV-Inaktivierung spielen und dass die UV-Inaktivierung bei einem gegebenen D bei einem niedrigeren P und einem längeren τs wirksamer ist27,28.

Hier gehen wir davon aus, dass sowohl ROS als auch UV-Strahlung DNA-Schäden verursachen. Abbildung 3 zeigt das quantitative Modell, das die Prozesse und ihre DNA-Schadensraten beschreibt: (i) Γ0 (cm2/mJ): die Rate, mit der UV-Strahlung durch die Bildung von Thymin-Dimeren direkt DNA-Schäden verursacht29,30,31,32, 33; (ii) Γ1 (cm3/s): die Geschwindigkeit, mit der ROS-Radikale Schäden an der DNA verursachen; (iii) Γ2 (cm2/mJ): die Geschwindigkeit der Erzeugung von ROS-Radikalen an den Bakterien durch UV-Strahlung; (iv) Γ3 (1/s): die Lebensdauer der ROS-Radikale 34,35,36,37; und (v) Γ4 (cm3/s): die Geschwindigkeit der gegenseitigen Zerstörung von ROS-Radikalen. In diesem Fall kann die Reduktionsrate der Bakterienzahl N(t) (1/cm3) und die Erzeugungsrate von ROS-Radikalen R(t) (1/cm3) als Funktion der Zeit (0≤t≤τ) ausgedrückt werden durch die folgenden stochastischen Differentialgleichungen:

wobei P die Bestrahlungsstärke (mW/cm2) ist. Durch Lösen dieser beiden Differentialgleichungen können sowohl N(t) als auch R(t) durch die Variable t mit P als Parameter beschrieben werden. Unter Berücksichtigung der Konstanten-D-Bedingung wie τ × P = D (mJ/cm2) = Konstante für die Lösung der obigen Gleichungen. (1) und (2) können wir die Wirksamkeit der Inaktivierung bei demselben D, aber unterschiedlichen Ps beschreiben.

Quantitatives Modell zur Beschreibung von DNA-Schadensprozessen. UV-Strahlung verursacht direkt DNA-Schäden durch die Bildung von Thymin-Dimeren oder die Erzeugung von ROS-Radikalen (rote Kreise) an Bakterien durch UV-Strahlung, die die DNA schädigen. Die DNA-Schadensraten werden wie folgt beschrieben: Γ0 (cm2/mJ): UV-Strahlung verursacht direkt DNA-Schäden durch die Bildung von Thymin-Dimeren, Γ1 (cm3/s): ROS-Radikale schädigen DNA, Γ2 (cm2/mJ): ROS Radikale werden durch UV-Strahlung an den Bakterien erzeugt, Γ3 (s−1): Lebensdauer der ROS-Radikale und Γ4 (cm3/s): gegenseitige Zerstörung der ROS-Radikale.

Hier beschreiben wir quantitativ das Verfahren zur Bestimmung jeder Rate basierend auf dem Ergebnis der 10 mJ/cm2-D- und 265-nm-Bestrahlung, die in Abb. 2a als repräsentatives Beispiel dargestellt ist. Wir integrieren Gl. (1) wie folgt:

Unter Berücksichtigung von Gl. (3) Im Grenzfall von τ→0 mit τ × P = D (mJ/cm2), wobei D konstant ist, kann Γ0 (cm2/mJ) durch den Wert des Log (N/N0)-Achsenabschnitts bestimmt werden. Wir haben Γ0 = 0,22 (cm2/mJ) erhalten. Hier stellen wir fest, dass diese theoretische Kurve nicht bei (0, 0), sondern bei (0, − Γ0D/2,3) beginnt, da P als P = D/τ beschrieben wird [siehe Gl. (3)]. Somit führt eine Verringerung von D zu einem größeren Wert des Achsenabschnitts. Diese Tendenz stimmt mit den experimentell beobachteten Werten des Achsenabschnitts überein, wie in Abb. 2a dargestellt.

Andere Parameter wie Γ1, Γ2 und Γ4 können durch die Kurveneigenschaften bestimmt werden, wie in Abb. 2d–f dargestellt. Beispielsweise spiegelt sich der Wert von Γ1 in der anfänglichen Steigung der Kurve wider, wie in Abb. 2d dargestellt, wobei die grüne Kurve durch Γ1 = 2 × 10−4 (cm3/s) und die rote Kurve durch beschrieben wird Γ1 = 2 × 10−3 (cm3/s) (rote Kreise sind experimentelle Ergebnisse), und die blaue Kurve wird durch Γ1 = 2 × 10−2 (cm3/s) beschrieben; daher wählen wir Γ1 = 2 × 10−3 (cm3/s). Als nächstes wird der Wert von Γ2 durch die Endsteigung der Kurve bestimmt, wie in Abb. 2e dargestellt, wobei die grüne Kurve durch Γ2 = 0,07 (cm2/mJ) und die rote Kurve durch Γ2 = 0,7 (cm2) beschrieben wird /mJ) (rote Kreise sind experimentelle Ergebnisse), und die blaue Kurve wird durch Γ2 = 7,0 (cm2/mJ) beschrieben; und wir wählen Γ2 = 0,7 (cm2/mJ). Der Parameter Γ4 wird durch Anpassen der Endhöhe der Kurve bestimmt, wie in Abb. 2f dargestellt, wobei die grüne Kurve durch Γ4 = 2,8 (cm3/s) und die rote Kurve durch Γ4 = 28 (cm3/s) beschrieben wird ) (rote Kreise sind experimentelle Ergebnisse) und die blaue Kurve wird durch Γ4 = 280 (cm3/s) beschrieben; und wir wählen Γ4 = 28 (cm3/s).

Die Lebensdauer von ROS korreliert mit Γ3 und Γ4, was nicht von der Bestrahlungswellenlänge abhängt. Nach der Bestimmung von Γ4 wird der Parameter Γ3 zu Γ3 = 1 (1/s) bestimmt. Die für Γ3 ermittelte Lebensdauer ist wahrscheinlich ein vernünftiger Wert, da sie gut mit zuvor gemeldeten Werten übereinstimmt34,35. Insbesondere können wir durch die Verwendung dieser Parameter von Γ0 bis Γ4, die auf der Grundlage der Ergebnisse von 265 nm und 10 mJ/cm2 bestimmt werden, theoretische Kurven von 265 nm für verschiedene Dosisbedingungen zeichnen. Die in Abb. 2a gezeigte blaue Kurve wurde für 265 nm und D = 5 mJ/cm2 unter Verwendung der gleichen Γ0 bis Γ4 gezeichnet.

Abbildung 2a, b, c zeigt die experimentellen Diagramme (durchgezogene Kreise) und theoretisch angepasste Kurven (durchgezogene Kurven), die durch das obige Anpassungsverfahren für Bestrahlungswellenlängen von 265 nm erhalten wurden [Abb. 2a], 280 nm [Abb. 2b] und 308 nm [Abb. 2c], wobei die roten Kreise und -Kurven jeweils einen D von 10 mJ/cm2 und die blauen Kreise und -Kurven einen D von 5 mJ/cm2 darstellen. Die Werte von τs zur Anpassung an die Kurven für jede Bestrahlungswellenlänge sind in Tabelle 2 angegeben. Die theoretischen Kurven erklären das Inaktivierungsverhalten gut als Funktion von τ unter verschiedenen Bestrahlungswellenlängen und D-Bedingungen. Obwohl die Annahme, dass ROS an der DNA-Schädigung beteiligt ist,27,28 ein Thema ist, das in Zukunft angegangen werden muss, sind wir der Ansicht, dass das hier vorgestellte stochastische Modell nicht nur die vorliegenden Ergebnisse, sondern auch den breiten Bereich der zuvor berichteten Inaktivierungsratenkonstanten gut erklärt12, 13,14,15,16,17,18,19.

Es ist interessant, den Unterschied in der Menge an ROS zu zeigen, die durch UV-Bestrahlung erzeugt wird, wenn D konstant, P jedoch unterschiedlich ist. Abbildung 4a zeigt das theoretische zeitliche Verhalten von R(t), das bei 0,01 mW/cm2 mit 1000 s (rote Kurve) oder 10 mW/cm2 mit 1 s (blaue Kurve im Einschub) bei der Bestrahlungswellenlänge von 265 nm erhalten wurde. Das zeitliche Verhalten beider R(t) zeigt ähnliche Kurveneigenschaften. Ein bemerkenswerter Punkt ist der Unterschied im Spitzenwert; Obwohl der P um den Faktor 1000 variiert, variiert der erhaltene Spitzenwert nur um den Faktor 60, beispielsweise 150 bei 10 mW/cm2 und 2,5 bei 0,01 mW/cm2. Dieser Unterschied ist auf den nichtlinearen Term Γ4R(t)R(t) zurückzuführen, der impliziert, dass der ROS-Zustand mit hoher Dichte instabil ist und eine gegenseitige Zerstörung von ROS auftritt38. Der Unterschied im Spitzenwert führt zu einem Unterschied in der Gesamtmenge an ROS bei demselben D. Abbildung 4b zeigt die Gesamtmenge an ROS als Funktion von τ bei demselben D (265 nm, 10 mJ/cm2). Aufgrund der langen Lebensdauer von ROS (Γ3) und des nichtlinearen Termes (Γ4) erzeugt eine schwächere Bestrahlungsstärke mit längerer Dauer eine größere Menge an ROS. Wir betrachten diesen Unterschied in der Menge an ROS als Funktion von τ als den physikalischen und chemischen Mechanismus, der den großen Unterschied in der Wirksamkeit der Inaktivierung bei gleichem D erklärt.

(a) Zeitliches Verhalten von R(t), erhalten bei 0,01 mW/cm2 mit 1000 s (rote Kurve) oder 10 mW/cm2 mit 1 s (blaue Kurve im Einschub) bei der Bestrahlungswellenlänge von 265 nm. (b) Gesamtmenge an ROS als Funktion der Bestrahlungsdauer bei derselben Dosis (265 nm, 10 mJ/cm2).

Bei der Bestrahlungswellenlänge von 308 nm konnten wir keine signifikante Änderung der Wirksamkeit gegenüber P beobachten. Dieses Ergebnis ähnelt den Ergebnissen von Oguma et al.16, steht jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen von Pousty et al.27. Der Grund dafür ist nicht klar; Wir glauben jedoch, dass dieser Unterschied in der Wirksamkeit auf den Unterschied im Stamm zurückzuführen ist: Während wir einen einfachen O1-Stamm verwendeten, haben Oguma et al. verwendeten den Stamm K12 IFO 330116, und Pousty et al. verwendete den Stamm MG166527. Um dieses Problem zu klären, werden derzeit weitere Stämme von E. coli-Bakterien untersucht. Die Tatsache, dass wir bei der Bestrahlungswellenlänge von 308 nm keine signifikante Verringerung der Wirksamkeit beobachten konnten, lässt wahrscheinlich darauf schließen, dass der Mechanismus der ROS-Erzeugung durch UV-Licht mit dem Absorptionsspektrum von DNA19,39,40 und/oder Protein41,42 korreliert. 43,44,45,46 Arten.

Die Tendenz im Verhalten des P und die in dieser Arbeit erzielte Wirksamkeit scheinen mit den früheren Studien übereinzustimmen9,13,47,48,49. Für ein kleineres P wurde eine höhere Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstante berichtet. Beispielsweise beträgt die berichtete Reduktionsrate bei einer Bestrahlungswellenlänge von 265 nm für den Stamm E. coli K12 29425 Log (N/N0) = − 1,5 für 5 mJ/cm2 und − 2,5 für 10 mJ/cm2 im kleineren P Bereich (0,030–0,060 mW/cm2)47; Im größeren P-Bereich (0,19–0,55 mW/cm2) nimmt die Reduktionsrate jedoch ab, da Log (N/N0) = − 1 für 5 mJ/cm2 und − 2 für 10 mJ/cm248 ist. Eine sehr ähnliche Tendenz wurde für E. coli CGMCC 1.3373 berichtet, und die berichtete Reduktionsrate beträgt Log (N/N0) = − 1,5 für 5 mJ/cm2 und − 4,5 für 10 mJ/cm2 im kleineren P-Bereich (0,05 mW/ cm2)13; Im größeren P-Bereich (0,384 mW/cm2) nimmt die Reduktionsrate jedoch ab, da Log (N/N0) = − 1 für 5 mJ/cm2 und − 3 für 10 mJ/cm249 ist.

Wir weisen hier darauf hin, dass die Geburts- und Todesprozesse von E. coli in dieser Analyse nicht berücksichtigt wurden, da die Inaktivierungstests in einer stationären Phase durchgeführt wurden [E. coli in einer normalen Kochsalzlösung (0,9 % NaCl)]. Wenn wir jedoch die UV-Inaktivierungstests in einer gut ernährten Phase (logarithmische Phase) durchführen, müssen wir die Vervielfältigungszeit berücksichtigen, da sich E. coli im gut ernährten Zustand alle 20 Minuten teilt50. In diesem Fall ist es notwendig, die Geburts- und Todesprozesse, die diesen Proliferationseffekt zeigen, in dieses stochastische Modell einzuführen.

In diesem Artikel haben wir den signifikanten Unterschied in der Wirksamkeit der Inaktivierung von E. coli bei gleichem D, aber unterschiedlichen Ps und τs bei einer festen Wellenlänge verdeutlicht. Obwohl die Thymin-Dimer-Produktion und die ROS-Produktion experimentell nicht bestätigt wurden, gehen wir davon aus, dass während des UV-Inaktivierungsprozesses neben der Bildung von Thymin-Dimeren in der DNA ein weiterer Faktor wie ROS eine wichtige Rolle bei der Inaktivierung von Bakterien spielte. Die Wirksamkeit der Inaktivierung durch ROS hängt vom P ab, während die Bildung von Thymin-Dimeren vom D abhängt. Um zu beweisen, dass ROS bei der Inaktivierung eine Rolle spielen, ist es notwendig, die Menge an ROS durch UV-Bestrahlung zu quantifizieren und zu messen.

Es wurden verschiedene Werte der Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstante für die UV-Inaktivierung eines Bakteriums und/oder Virus berichtet, selbst wenn dieselbe Lichtquelle und Bestrahlungswellenlänge verwendet wird9,10,11. Ein Grund für diese Diskrepanz könnte der Unterschied in den Stämmen und deren Umgebungen der Bakterien sein. Den hier erhaltenen experimentellen und theoretischen Ergebnissen zufolge ist es jedoch wahrscheinlich, dass sich die bisher gemeldeten UV-Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten aus Mischwerten zweier Inaktivierungsprozesse zusammensetzen, die von der Größe von P abhängen. Daher sind die in der In der Literatur gibt es große Unterschiede, selbst wenn dieselbe Strahlungswellenlänge sowie dieselben Arten und Stämme von Bakterien und Viren verwendet wurden. Um die Anwendbarkeit des hier erhaltenen Modells auf eine breitere Gruppe von Krankheitserregern zu validieren, sind Inaktivierungsexperimente erforderlich, die eine kurzfristige Bestrahlung mit hohem P kombinieren, um die tatsächlichen UV-Inaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten zu bestimmen.

Die Menge an UV-Strahlung, der der menschliche Körper ausgesetzt sein kann, ist durch einen Schwellenwert (TLV) für jede Wellenlänge begrenzt, basierend auf der TLV-Broschüre der American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH)51. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass bei gleichem D die Inaktivierung bei einem niedrigeren P und einem längeren τ effizienter ist als die Inaktivierung bei einem höheren P und einem kürzeren τ. Die Wirksamkeit einer längeren UV-Bestrahlung bei einem niedrigeren P kann den D und das Risiko für den menschlichen Körper verringern. Daher halten wir diese Informationen für nützlich für die zukünftige Sterilisation großer Räume wie Krankenhauszimmer mit UV-Licht. Um solche Beleuchtungstechnologien mit keimtötender Wirkung zu erreichen, ist es notwendig, die Wirkung von P unter den gleichen D-Bedingungen auf verschiedene Arten pathogener Bakterien und Viren zu untersuchen.

Die in der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren möchten Yuji Kohmura, Haruka Hattori und Ton Mu für ihre Hilfe bei den UV-Inaktivierungsexperimenten danken. Die Autoren danken außerdem Dr. Masanori Isaka und Dr. Hideyuki Matsui für Informationen über Techniken zur Handhabung von Bakterien. Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Research an der Nagoya City University (Grant-Nummer 2121102) unterstützt.

Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, Nagoya, 467-8601, Japan

Takahiro Matsumoto, Ichiro Tatsuno und Tadao Hasegawa

Graduiertenschule für Design und Architektur, Nagoya City University, Nagoya, 464-0083, Japan

Takahiro Matsumoto und Yukiya Yoshida

Fachbereich Physik, Fakultät für Naturwissenschaften, Shizuoka-Universität, Shizuoka, 422-8529, Japan

Makoto Tomita

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TM ist der Erstautor. IT, YY, MT und TH trugen zum Design des UV-LED-Inaktivierungssystems bei; YY, IT und TM führten die UV-LED-Inaktivierungsexperimente von E. coli durch; und TH stellte technische Unterstützung und bakterielles Fachwissen für Bakterienwachstumstechniken bereit. TMMT und YY erstellten und analysierten das quantitative Modell, das den Unterschied in der Inaktivierungswirksamkeit gegenüber der Bestrahlungsstärke bei derselben Dosis beschreibt. Alle Autoren haben dieses eingereichte Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Takahiro Matsumoto.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Matsumoto, T., Tatsuno, I., Yoshida, Y. et al. Zeit-Dosis-Reziprozitätsmechanismus für die Inaktivierung von Escherichia coli, erklärt durch einen stochastischen Prozess mit zwei Inaktivierungseffekten. Sci Rep 12, 22588 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26783-x

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Eingegangen: 05. Juni 2022

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 30. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26783-x

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